Покращена біомаса, ліпіди та біоактивні сполуки з генетично модифікованих мікроводоростей на основі CRISPR-Cas9, CRISPRi та ASGARD: перспективний рубіж у біотехнології
Автор(и)
,
Кумар Т.С.2,
Ашок Кумар С.3,
Дхарані Г.2,
Кірубагаран Р.2
2 Відділ морської біотехнології, Національний інститут океанічних технологій, Міністерство наук про Землю, Уряд Індії, Паллікаранай, Ченнаї-600 100, Тамілнад, Індія
3 Центр біотехнології, Університет Анни, Ченнаї-600 025, Тамілнад, Індія
Розділ:
ГенетикаНомер:
Том 35 № 2 (2025)Сторінки:
85-103DOI:
https://doi.org/10.15407/alg35.02.85Анотація
В останні роки генна інженерія досягла значних успіхів у використанні потенціалу мікроводоростей для різних цілей, включаючи збільшення виробництва біомаси, біопалива, очищення стічних вод та синтез цінних біологічно активних сполук. Наше попереднє дослідження довело, що генетичні модифікації Chlorella vulgaris Beijer. з використанням випадкового мутагенезу значно підвищують вміст ліпідів, що робить її більш придатною для виробництва біопалива. Однак ефективні інструменти генної інженерії все ще не здатні одночасно збільшувати загальне виробництво біомаси та біологічно активних сполук. У цьому огляді обговорюються найновіші інструменти та стратегії використання для удосконалення біотехнологічного потенціалу штамів мікроводоростей, від культивування до сучасних методів редагування генів, таких як кластерні регулярно розташовані короткі паліндромні повтори (CRISPR) та CRISPR- асоційований білок 9 (CRISPR-Cas9). Численні дослідження показали, що метод цільових нуклеаз є визначним прогресом у маніпуляціях з геномом, забезпечуючи неперевершену точність. Новий варіант CRISPR, відомий як техніка CRISPRi, дає значні результати при роботі з мікроводоростями навіть у нестресових умовах. Крім того, для усунення труднощів, пов'язаних з високим вмістом гуаніну-цитозину в ДНК мікроводоростей, разом з CRISPRi було досліджено новий підхід — адаптивне однонаправляюче допоміжне регулювання ДНК (ASGARD), що забезпечив вищий вміст ліпідів і білків, завдяки чому його широко застосовують у виробництві. В огляді аналізуються переваги та недоліки різних інструментів генної інженерії, а також обговорюються складність і точність, необхідні для генетичної модифікації, і результуючий потенціал для покращення продуктивності біомаси, ліпідів і біоактивних сполук у морських мікроводоростей.
Ключові слова:
Chlorella vulgaris, CRISPR-Cas9, біоактивні сполуки, біомаса, біопаливо, генетична інженерія, мікроводоростіТекст статті
Посилання
Anthony J., Rangamaran V.R., Gopal D., Shivasankarasubbiah K.T., Thilagam M.L., Peter Dhassiah M., Padinjattayil D.S., Valsalan V.N., Manambrakat V., Dakshinamurthy S., Thirunavukkarasu S., Ramalingam K. 2015. Ultraviolet and 5'Fluorodeoxyuridine Induced Random Mutagenesis in Chlorella vulgaris and Its Impact on Fatty Acid Profile: A New Insight on Lipid-Metabolizing Genes and Structural Characterization of Related Proteins. Mar. Biotechnol. 17(1): 66–80. https://doi.org/10.1007/s10126-014-9597-5 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25189135
Baek K., Yu J., Jeong J., Sim S.J., Bae S., Jin E. 2018. Photoautotrophic production of macular pigment in a Chlamydomonas reinhardtii strain generated by using DNA-free CRISPR-Cas9 RNP-mediated mutagenesis. Biotechnol. Bioeng. 115(3): 719–728. https://doi.org/10.1002/bit.26499 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29150930
Bleisch R., Freitag L., Ihadjadene Y., Sprenger U., Steingröwer J., Walther T., Krujatz F. 2022. Strain Development in Microalgal Biotechnology - Random Mutagenesis Techniques. Life. 12(7): 961. https://doi.org/10.3390/life12070961 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/35888051 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9315690
Capecchi M.R. 2005. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genet. 6(6): 507–512. https://doi.org/10.1038/nrg1619 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15931173
Chang K.S., Kim J., Park H., Hong S.J., Lee C.G., Jin E. 2020. Enhanced lipid productivity in AGP knockout marine microalga Tetraselmis sp. using a DNA-free CRISPR-Cas9 RNP method. Biores. Technol. 303: 122932. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2020.122932 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32058903
Daboussi F., Leduc S., Maréchal A., Dubois G., Guyot V., Perez-Michaut C., Amato A., Falciatore A., Juillerat A., Beurdeley M., Voytas D.F., Cavarec L., Duchateau P. 2014. Genome engineering empowers the diatom Phaeodactylum tricornutum for biotechnology. Nat. Commun. 5: 3831. https://doi.org/10.1038/ncomms4831 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24871200
Dent R.M., Han M., Niyogi K.K. 2001. Functional genomics of plant photosynthesis in the fast lane using Chlamydomonas reinhardtii. Trends Plant Sci. 6(8): 364–371. https://doi.org/10.1016/S1360-1385(01)02018-0 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11495790
Dhokane D., Shaikh A., Yadav A., Giri N., Bandyopadhyay A., Dasgupta S., Bhadra B. 2023. CRISPR-based bioengineering in microalgae for production of industrially important biomolecules. Front Bioeng. Biotechnol. 26(11): 1267826. https://doi.org/10.3389/fbioe.2023.1267826 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/37965048 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10641005
Emmanuel S.O., Onome E., Charles O.O., Timothy P.C.E., Raphael N., Chukwudozie K.I., Abiodun O., Joshua I.O. 2022. Microalgae biorefinery: An integrated route for the sustainable production of high-value-added products. 16: 100323. https://doi.org/10.1016/j.ecmx.2022.100323
Esquível M.G., Matos A.R., Marques Silva J. 2017. Rubisco mutants of Chlamydomonas reinhardtii display divergent photosynthetic parameters and lipid allocation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 101(13): 5569–5580. https://doi.org/10.1007/s00253-017-8322-5 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28526981
Gaj T., Gersbach C.A., Barbas C.F. 2013. 3rd. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31(7): 397–405. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2013.04.004 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23664777 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3694601
Gilchrist E.J., O'Neil N.J., Rose A.M., Zetka M.C., Haughn G.W. 2006. TILLING is an effective reverse genetics technique for Caenorhabditis elegans. BMC Genom. 7: 262. https://doi.org/10.1186/1471-2164-7-262 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17049087 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1626091
Greiner A., Kelterborn S., Evers H., Kreimer G., Sizova I., Hegemann P. 2017. Targeting of photoreceptor genes in Chlamydomonas reinhardtii via zinc-finger nucleases and CRISPR/Cas9. Plant Cell. 29(10): 2498–2518. https://doi.org/10.1105/tpc.17.00659 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28978758 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5774583
Gupta R.M., Musunuru K. 2014. Expanding the genetic editing tool kit: ZFNs, TALENs, and CRISPR-Cas9. J. Clin. Invest. 124(10): 4154–4161. https://doi.org/10.1172/JCI72992 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25271723 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4191047
Hao X., Luo L., Jouhet J., Rébeillé F., Maréchal E., Hu H., Pan Y., Tan X., Chen Z., You L., Chen H., Wei F., Gong Y. 2018. Enhanced triacylglycerol production in the diatom Phaeodactylum tricornutum by inactivation of a Hotdog-fold thioesterase gene using TALEN-based targeted mutagenesis. Biotechnol. Biofuels. 11: 312. https://doi.org/10.1186/s13068-018-1309-3 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30455741 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6231261
Henikoff S., Till B.J., Comai L., Division B.S., Hutchinson F., Washington S.H. 2004. Perspectives on Translational Biology TILLING. Traditional Mutagenesis Meets Functional Genomics. Cancer Res. 135(2): 630–636. https://doi.org/10.1104/pp.104.041061 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15155876 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC514099
Henning K., Anastasios M. 2014. The chloroplast signal recognition particle (CpSRP) pathway as a tool to minimize chlorophyll antenna size and maximize photosynthetic productivity. Biotechnol. Adv. 32: 66–72. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.08.018 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24013010
Hlavova M., Turoczy Z., Bisova K. 2015. Improving microalgae for biotechnology - From genetics to synthetic biology. Biotechnol. Adv. 33(6): 1194–1203. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2015.01.009 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25656099
Holkers M., Maggio I., Liu J., Janssen J.M., Miselli F., Mussolino C., Recchia A., Cathomen T., Gonçalves M.A. 2013. Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells. Nucl. Acids Res. 41(5): e63. https://doi.org/10.1093/nar/gks1446 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23275534 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3597656
Hu J., Wang D., Chen H., Wang Q. 2023. Advances in Genetic Engineering in Improving Photosynthesis and Microalgal Productivity. Int. J. Mol. Sci. 24(3): 1898. https://doi.org/10.3390/ijms24031898 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/36768215 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9915242
Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. 2012. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337(6096): 816821. https://doi.org/10.1126/science.1225829 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22745249 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6286148
Josephine A., Vijaya Raghavan R., Kumar T.S., Nagendran N., Dharani G., Kirubagaran R. 2022. An insight into the influence of random mutagenesis on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris a transcriptome study. Biomass Conv. Bioref. 14(13): 1–16. https://doi.org/10.1007/s13399-022-03249-8
Khan S., Al-Qurainy F., Anwar F. 2009. Sodium azide: a chemical mutagen for enhancement of agronomic traits of crop plants. Environ. We Int. J. Sci. Techol. 4: 1–21.
Kim J., Chang K.S., Lee S., Jin E. 2021. Establishment of a Genome Editing Tool Using CRISPR-Cas9 in Chlorella vulgaris UTEX395. Int. J. Mol. Sci. 22(2): 480. https://doi.org/10.3390/ijms22020480 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33418923 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7825080
Kurita T., Moroi K., Iwai M., Okazaki K., Shimizu S., Nomura S., Saito F., Maeda S., Takami A., Sakamoto A., Ohta H., Sakuma T., Yamamoto T. 2020. Efficient and multiplexable genome editing using Platinum TALENs in oleaginous microalga, Nannochloropsis oceanica NIES-2145. Gen. Cells. 25(10): 695–702. https://doi.org/10.1111/gtc.12805 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32888368
Lin W.R., Ng I.S. 2020. Development of CRISPR/Cas9 system in Chlorella vulgaris FSP-E to enhance lipid accumulation. Enzyme Microbiol. Technol. 133: 109458. https://doi.org/10.1016/j.enzmictec.2019.109458 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31874693
Lin J.Y., Lin W.R., Ng I.S. 2022. CRISPRa/i with Adaptive Single Guide Assisted Regulation DNA (ASGARD) mediated control of Chlorella sorokiniana to enhance lipid and protein production. Biotechnol. J. 17(10): e2100514. https://doi.org/10.1002/biot.202100514 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/34800080
Ma X., Yao L., Yang B., Lee Y.K., Chen F., Liu J. 2017. RNAi-mediated silencing of a pyruvate dehydrogenase kinase enhances triacylglycerol biosynthesis in the oleaginous marine alga Nannochloropsis salina. Sci. Rep. 7: 11485. https://doi.org/10.1038/s41598-017-11932-4 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28904365 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5597597
Maeder M.L., Thibodeau-Beganny S., Sander J.D., Voytas D.F., Joung J.K. 2009. Oligomerized pool engineering (OPEN): an 'open-source' protocol for making customized zinc-finger arrays. Nat. Prot. 4(10): 1471–1501. https://doi.org/10.1038/nprot.2009.98 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19798082 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2858690
Maeder M.L., Thibodeau-Beganny S., Osiak A., Wright D.A., Anthony R.M., Eichtinger M., Jiang T., Foley J.E., Winfrey R.J., Townsend J.A., Unger-Wallace E., Sander J.D., Müller-Lerch F., Fu F., Pearlberg J., Göbel C., Dassie J.P., Pruett-Miller S.M., Porteus M.H., Sgroi D.C., Iafrate A.J., Dobbs D., McCray P.B., Jr., Cathomen T., Voytas D.F., Joung J.K. 2008. Rapid "open-source" engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification. Mol. Cell. 31(2): 294–301. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2008.06.016 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18657511 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2535758
McManus M.T., Sharp P.A. 2002. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat. Rev. Genet. 3(10): 737–747. https://doi.org/10.1038/nrg908 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12360232
Negi S., Perrine Z., Friedland N., Kumar A., Tokutsu R., Minagawa J., Berg H., Barry A.N., Govindjee G., Sayre R. 2020. Light regulation of light-harvesting antenna size substantially enhances photosynthetic efficiency and biomass yield in green algae. Plant J. 103: 584–603. https://doi.org/10.1111/tpj.14751 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32180283
Park S., Nguyen T.H.T., Jin E. 2019. Improving lipid production by strain development in microalgae: Strategies, challenges and perspectives. Biores. Technol. 292: 121953. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2019.121953 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31405625
Pei-Hsun K.I., I-Son N. 2017. CRISPRi mediated phosphoenolpyruvate carboxylase regulation to enhance the production of lipid in Chlamydomonas reinhardtii. Biores. Technol. 245(Pt B): 15271537. https://doi.org/10.1016/j.biortech.2017.04.111 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28501380
Polle J.E., Kanakagiri S.D., Melis A. 2003. TLA1, a DNA insertional transformant of the green alga Chlamydomonas reinhardtii with a truncated light-harvesting chlorophyll antenna size. Planta. 217(1): 49–59. https://doi.org/10.1007/s00425-002-0968-1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12721848
Ramirez C.L., Foley J.E., Wright D.A., Müller-Lerch F., Rahman S.H., Cornu T.I., Winfrey R.J., Sander J.D., Fu F., Townsend J.A., Cathomen T., Voytas D.F., Joung J.K. 2008. Unexpected failure rates for modular assembly of engineered zinc fingers. Nat. Methods. 5(5): 374–375. https://doi.org/10.1038/nmeth0508-374 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18446154 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7880305
Rathod J.P., Vira C., Lali A.M, Prakash G. 2020. Metabolic engineering of Chlamydomonas reinhardtii for enhanced в-carotene and lutein production. Appl. Biochem. Biotechnol. 190(4): 1457–1469. https://doi.org/10.1007/s12010-019-03194-9 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31782090
Schüler L., Greque de Morais E., Trovão M., Machado A., Carvalho B., Carneiro M., Maia I., Soares M., Duarte P., Barros A., Pereira H., Silva J., Varela J. 2020. Isolation and Characterization of Novel Chlorella vulgaris Mutants With Low Chlorophyll and Improved Protein Contents for Food Applications. Front. Bioeng. Biotechnol. 8: 469. https://doi.org/10.3389/fbioe.2020.00469 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/32509750 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7248561
Sizova I., Greiner A., Awasthi M., Kateriya S., Hegemann P. 2013. Nuclear gene targeting in Chlamydomonas using engineered zinc-finger nucleases. Plant J. 73(5): 873–882. https://doi.org/10.1111/tpj.12066 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23137232
Song I., Kim J., Baek K., Choi Y., Shin B., Jin E. 2020. The generation of metabolic changes for the production of high-purity zeaxanthin mediated by CRISPR-Cas9 in Chlamydomonas reinhardtii. Microbial. Cell Fact. 19(1): 220. https://doi.org/10.1186/s12934-020-01480-4 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/33256757 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7708255
Song I., Kim S., Kim J., Oh H., Jang J., Jeong S.J., Baek K., Shin W.S., Sim S.J., Jin E. 2022. Macular pigment-enriched oil production from genome-edited microalgae. Microbial. Cell Fact. 21(1): 27. https://doi.org/10.1186/s12934-021-01736-7 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/35183173 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8858528
Sunipa S., Gour G.S. 2021. CRISPR mediated Lipid Enhancement in Microalgae. Res. J. Biotechnol. 16: 220226.
Takahashi K., Ide Y., Hayakawa J., Yoshimitsu Y., Fukuhara I., Abe J., Kasai Y., Harayama S. 2018. Lipid productivity in TALEN-induced starchless mutants of the unicellular green alga Coccomyxa sp. strain Obi. Algal Res. 32: 300–307. https://doi.org/10.1016/j.algal.2018.04.020
Trovão M., Schüler L.M., Machado A., Bombo G., Navalho S., Barros A., Pereira H., Silva J., Freitas F., Varela J. 2022. Random Mutagenesis as a Promising Tool for Microalgal Strain Improvement towards Industrial Production. Mar Drugs. 20(7): 440. https://doi.org/10.3390/md20070440 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/35877733 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9318807
Urnov F.D., Rebar E.J., Holmes M.C., Zhang H.S., Gregory P.D. 2010. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11(9): 636–646. https://doi.org/10.1038/nrg2842 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20717154
Verruto J., Francis K., Wang Y., Low M.C., Greiner J., Tacke S., Kuzminov F., Lambert W., McCarren J., Ajjawi I., Bauman N., Kalb R., Hannum G., Moellering E.R. 2018. Unrestrained markerless trait stacking in Nannochloropsis gaditana through combined genome editing and marker recycling technologies. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 115(30): E7015E7022. https://doi.org/10.1073/pnas.1718193115 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29987047 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6065045
Wyman C., Kanaar R. 2006. DNA double-strand break repair: all's well that ends well. Annu. Rev. Genet. 40: 363–383. https://doi.org/10.1146/annurev.genet.40.110405.090451 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16895466
Xing W., Zhang R., Shao Q., Meng C., Wang X., Wei Z., Sun F., Wang C., Cao K., Zhu B., Gao Z. 2021. Effects of laser mutagenesis on microalgae production and lipid accumulation in two economically important fresh Chlorella strains under heterotrophic conditions. Agronomy. 11: 961. https://doi.org/10.3390/agronomy11050961
Yang L., Guell M., Byrne S., Yang J.L., De Los Angeles A., Mali P., Aach J., Kim-Kiselak C., Briggs A.W., Rios X., Huang P.Y., Daley G., Church G. 2013. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucl. Acids Res. 41(19): 9049–9061. https://doi.org/10.1093/nar/gkt555 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23907390 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3799423
Zakhrabekova S.M., Gough S., Lundh L., Hansson M. 2013. Functional Genomics and Forward and Reverse Genetics Approaches for Identification of Important QTLs in Plants. Proc. Azerbaijan Natl. Acad. Sci. 68: 23–28.
Zhang C., Hu H. 2014. High-efficiency nuclear transformation of the diatom Phaeodactylum tricornutum by electroporation. Mar. Gen. 16: 63–66. https://doi.org/10.1016/j.margen.2013.10.003 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24269346
